Se describe el uso de anavenenos ofídícos, obtenidos por desnaturalización térmica de veneno entero de ofidios. Se trataron 50 animales (18 felinos y 32 caninos) afectados por diferentes tumores por medio de inyección parenteral de anavenenos bothrópico y bothrópico -crotálico. Los resultados fueron un 80% de tratamientos exitosos en tumores mamarios y 22% de éxito en tratamiento de carcinoma de células escamosas felino, pero con resultados menos exitosos en el caso de linfoma y osteosarcoma canino. Se describen los probables mecanismos de acción de estos compuestos y su comparación con experiencias realizadas con otros venenos.
Summary
The use of ophidians anavenoms, obtained by means of termic desnaturalization it is described. 50 tumors affected animals were treated (18 felines and 32 canines) by parenteral injection of bothropic and bothropic-crotalic anavenims. The results were 80% of sucesfully treatment in mamarian tumors and 22% in feline squamous cell carcinoma, but unsucesfully treatment in canine limphoma and osteosarcoma. The teorical mechanism of action of this compunds it is described and their comparison with similar experiences in other ophidians venoms.
Nota: Observara un número al lado de los parrafos, estos seran las citas de las bibliografias de Anavenenos Ofídicos.
¿Como es el uso de Anavenenos Ofídicos?
El uso del veneno de las serpientes como tratamiento de diferentes enfermedades crónicas es un tema conocido desde la antigüedad. Sus distintas aplicaciones no son una novedad y ya figuran en farmacopeas que datan de varios siglos. A pesar de esto, solo en los años veinte ingresan seriamente en el campo de la terapéutica y se los empieza a estudiar sistemáticamente. Se comenzó intentando neutralizar la fracción tóxica de los anavenenos ofídicos sobre la base de distintas metodos físicos y químicos, para llegar a obtener sueros antiofidicos y luego a los llamados anavenenos. Se denomina anavenenos los venenos detoxificados de origen animal.
Los venenos de serpientes (anavenenos ofídicos), arañas, sapos, escorpiones, peces, insectos, etc., pueden ser transformados en anavenenos por medio de métodos fisico-quimicos, para luego ser empleados en la inmunización activa contra fracciones tóxicas del propio veneno o para otros usos terapéuticos. El veneno crudo pierde la capacidad tóxica original, pero conserva una acción farmacología especialmente antitumoral, antiartrósica, antirreumática e incluso analgésica o antialgica.
1. Fundación de Estudios Biológicos. Gral. Urquiza 1940/42 (1234). Buenos Aires. Argentina. 2. Instituto Nacional de Producción de biológicos «Carlos Malbran » ANLIS. Av. Velez Sarsfield 560- (1142)- Buenos Aires- Argentina. 3. Médicos Veterinarios -Ejercicio Libre de la profesión.
Investigadores del siglo pasado han aportado una abundante bibliografía con trabajos personales sobre el tema y entre ellos podemos citar en Francia a Koressios, Gosset y Calmette; en Brasil a Vital Brasil y Amaral y en nuestro país a Castro Escalada, Rossi, Nicolini, Ramírez Calderón, Houssay, Barrio entre los más importantes.
Los anavenenos, una vez obtenidos, conservan ciertas fracciones del veneno nativo, por lo general proteínas con actividad enzimática que resisten la desnaturalización que lleva el proceso. La mayoría de esas enzimas son Fosfolipasas A2 (PLA2) que tienen una acción hemolítica, proteolítica y citolítica, además de la capacidad de unirse a factores de crecimiento presentes en las membranas de células tumorales. Su mecanismo de acción se basa en la alteración de las propiedades fisico-químicas de las membranas celulares, provocando la lisis y muerte de las células.
El presente trabajo resume la experiencia de un grupo de profesionales con la utilización de anavenenos ofídicos en el tratamiento de diversos tumores en caninos y felinos.
Materiales y Métodos para el uso de Anavenenos Ofídicos
Se trabajó con anavenenos elaborados por la Fundación de Estudios Biológicos y que consisten básicamente en la desnaturalización del veneno entero obtenido de ejemplares vivos de crotálidos, por medio de tratamientos a diferentes temperaturas y la preparación final estéril a una concentración de 1 mg/ml. aproximadamente.
Si bien existen varios anavenenos (Monovalente crotálico, Monovalente bothrópico y bivalente bothrópico-crotálico), se utilizaron solo dos tipos, monovalente bothrópico y bivalente bothrópico-crotálico, los cuales se inyectaron por vía parenteral a los animales afectados, por medio de la inyección subcutánea o intramuscular, utilizando material descartable estéril.
Las muestras de los diferentes anavenenos fueron testadas por un estudio inmunoquímico de doble inmunoprecipitación en gel de agarosa al 1% en NaCl 0.15 M, enfrentándolos a sueros específicos y heterólogos, observándose las bandas de precipitación.
El estudio electroforético se realizó por medio de la técnica de gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en un gel homogéneo al 12% en un sistema Miniprotean II (BioRad), corriendo los anavenenos con venenos crudos y marcadores de peso molecular de amplio espectro (Sigma Wide Range 14-205 Kda).
Criterios de inclusión del uso de Anavenenos Ofídicos
Los animales incluidos en el presente trabajo fueron caninos y felinos domésticos de distintos sexos, razas y edad, afectados por diferentes tipos de tumores. Se eligieron aquellos animales que no se encontraban recibiendo tratamiento al momento de decidir su inclusión y que no hubieran recibido tratamientos previos con anavenenos.
Todos los animales fueron sometidos a análisis previos comprendiendo un hemograma completo y distintas determinaciones bioquímicas como Proteínas Totales, albúminas, globulinas, urea, creatinina, FA, GOT, GPT y glucemia.
Resultados del uso de Anavenenos Ofídicos
Las muestras de anaveneno procesadas con el estudio inmunoquímico demostraron la existencia de bandas de precipitación entre el suero antibothrópico y los anavenenos bothrópico y bothrópico-crotálico, siendo negativo al enfrentar este antiveneno con el anaveneno crotálico. Por otro lado, el suero anticrotálico reacciona con el anaveneno crotálico y anaveneno bothrópico-crotálico, no observándose bandas frente al anaveneno bothrópico. Asumiendo las limitaciones de esta técnica se puede decir que los anavenenos poseen los venenos declarados en cantidades suficientes para ser detectados por esta técnica y no poseen contaminantes de origen animal.
En el estudio electroforético se observó una banda mayor en concordancia con la banda de 15 Kda, en correspondencia con las bandas de veneno crudo en las que se encuentra la actividad fosfolipásica (Fig. 1). Se observan además trazas de materiales de peso molecular algo mayor con relación a proteínas de actividad procoagulante, en especial en anavenenos bothrópicos.
Los animales tratados fueron 50, de los cuales 18 (32%) son felinos y 32 (68%) caninos de distintas edades, sexos y razas, con diferentes tipo de tumores.
Todos los felinos estaban afectados por Carcinoma de Células Escamosas en diferentes estadios de evolución y fueron tratados con inyección subcutánea de anaveneno monovalente bothrópico y anaveneno bivalente (bothrópico-crotálico) a una dosis de 0.25 cc c/24 hs durante 5 días y luego 0.50 ccC/48 hs durante el resto del tratamiento, incrementando la dosis en 0.1 cc en cada mes de tratamiento posterior al primer mes. El tiempo de tratamiento varió desde 4 meses hasta dos años. De los animales tratados, 4 (22%) han sobrevivido a la fecha, mientras que los 14 restantes (78%) fallecieron durante el transcurso del tratamiento.
La mayoría de los casos fatales (80%), murió al cabo de dos meses de tratamiento, mientras que el resto sobrevivió hasta un año.
En el caso de los caninos los mismos estaban afectados por tumores mamarios (20 casos, 62%), Osteosarcoma (5 casos, 16%), Carcinoma de células escamosas (2 casos, 4%) y leucemia (5 casos, 16%). Los animales fueron tratados con anavenenos monovalente bothrópico y bivalente bothrópico-crotálico por vía parenteral (intramuscular o subcutánea) a una dosis de 0.25 cc c/24 hs durante 5 días y luego 0.50 ccC/48 hs durante el resto del tratamiento, incrementando la dosis en 0.1 cc en cada mes de tratamiento posterior al primer mes.
El tratamiento en los caninos afectados de tumores de mama (adenocarcinomas lobulillares, carcinoma sólido mamario con metástasis) fue exitoso en 16 casos (80 %) con reducción de masas tumorales, desaparición de sintomatología respiratoria en los casos de metástasis y una sobrevida promedio de dos años. En los dos casos restantes, la muerte se produjo por complicaciones ajenas al tratamiento o bien al proceso patológico como torsión de estomago e insuficiencia renal.
En el caso de los dos casos de carcinoma de células escamosas, ambos animales tratados se mantienen a la fecha en un buen estado de salud, las lesiones tumorales se han mantenido estables, con leves cambios y solo se pueden mencionar contaminaciones periódicas con bacteria que cedieron con tratamiento especifico.
Los casos tratados de osteosarcoma canino no han respondido bien el tratamiento. Efectivamente, 2 casos tratados murieron dentro de los 3 meses de iniciado el tratamiento, uno al cabo de 5 meses y los dos restantes han mostrado una reducción en el crecimiento del tumor, aunque al cabo de 6 meses aun persiste la deformación y continúan en tratamiento.
Finalmente los 5 casos de linfoma canino tratados (con y sin leucemia), tampoco respondieron bien al tratamiento y solo se puede mencionar un caso que tuvo una sobrevida de 8 meses, en tanto los restantes murieron en los dos meses de iniciado el tratamiento. Solo fue posible observar una disminución del tamaño de los ganglios superficiales afectados y una mejoría en el estado general con ausencia de dolor con Anavenenos Ofídicos.
Los animales tratados no mostraron signos de toxicidad o hipersensibilidad por el uso de los anavenenos. En solo dos casos (4%) tratados los propietarios de los animales refirieron dolor al momento de la aplicación intramuscular, el cual cedió al cabo de un día sin tratamientos o bien cuando se cambio la vía de administración por la vía subcutánea. Esto se debe probablemente a la base alcohólica en que se mantienen los anavenenos.
También se han descripto tres episodios aislados de paresia o parálisis de los miembros posteriores, los cuales cedieron al cambiar la vía de administración de la vía intramuscular a la subcutánea. En la mayoría de los casos se describe un efecto benéfico sobre la calidad de vida del animal tratado y ausencia de dolor.
Con respecto a los valores hematológicos los animales tratados mostraron un aumento del recuento de glóbulos rojos, aumento de valores de hemoglobina y hematocrito. , También se observa una eosinofilia que llega en algunos casos hasta el 8% sin manifestaciones generales.
Los valores de urea, creatinina y proteínas totales, así como albúminas y globulina se mantienen sin alteraciones y en algunos animales tienden a normalizarse al cabo de un mes de tratamiento. Los valores de enzimas hepáticas (ALT y AST, FAS) tampoco se vieron afectado, manteniendo sus valores normales en animales tratados o una tendencia a la normalización al cabo de uno o dos meses de tratamiento.
Conclusiones y Discusión del uso de Anavenenos Ofídicos
Tal como ha sido explicado en la introducción, el uso de Anavenenos Ofídicos en el tratamiento de diferentes enfermedades se conoce hace mucho tiempo 1,3,21.
La utilización de anavenenos ofidicos no provoca los efectos colaterales frecuentemente observados tanto con la administración de drogas oncológicas como con la aplicación de radioterapia.
Esta característica, sumada a la simplicidad de manejo en cuanto a via de administración, hace a los anavevenos una posibilidad terapéutica indicada para tratar carcinoma de células escamosas felino y tumores mamarios caninos que por variadas circunstancias se consideran inoperables.
Los venenos de serpientes o sus componentes no actúan con la estructura del ADN y no son antimetabolitos o inhibidores enzimáticos. El mecanismo de acción de estos compuestos obtenidos tras la desnaturalización de los venenos ofídicos, se basa en la acción de enzimas termoestables llamadas Fosfolipasas A2 (PLA2), las cuales se encuentran presentes en cantidades variables en los venenos ofídicos enteros y también en sus anavenenos, tal como se aprecia claramente en las electroforesis realizadas y que se presentan en la figura 1.
Las PLA2 actúan sobre diferentes tipos de membranas alterando sus componentes y provocando la lisis de las células, por ejemplo sobre eritrocitos 5,12 y sobre diferentes tipos celulares tumorales 2, 15
Los mecanismos de acción intimo de estos compuestos enzimáticos de venenos de serpientes, aun no se han dilucidado totalmente y permanecen en el ámbito teórico. Algunos autores sostienen que las PLA2 actúan sobre ciertas células blanco, uniéndose a los fosfolípidos de la membrana y causando alteraciones irreversibles de estos compuestos que llevan a la lisis celular 5, mientras que otras fuentes bibliográficas que trabajaron con venenos de Crotalus durissus terrificus y Bothrops jararaca, mencionan la activación funcional de los macrófagos como principal acción sobre los tumores y un mecanismo indirecto basado en la estimulación de la respuesta inflamatoria que inhibe el crecimiento de los tumores 7.
En otras experiencias realizadas con Anavenenos Ofídicos de crotálidos sudamericanos enteros sobre poblaciones celulares de tumores, se ha logrado una detención del patrón de crecimiento de estas células y cuando se discontinuo el tratamiento las células cancerosas recuperan su tasa de crecimiento y en un tercer estudio realizado con veneno de Crotalus durissus terrificus se describe que la acción antiproliferativa de los anavenenos ofídicos o sus componentes se debe a la unión de estos elementos a la membrana plasmática de las células blanco, en este caso las células tumorales 8,9,18.
Esto lleva a una perturbación estructural y alteraciones de la membrana que conducen una alteración de los mecanismos de regulación trasmembrana, seguido por alteraciones de la permeabilidad de la membrana y muerte de la célula. Dado que los anavenenos utilizados en este estudio se basan en venenos de especies argentinas de crotálidos (Bothrops y Crotalus) es posible inferir entonces que el mecanismo de acción se debe a la presencia de PLA2 termoestables presentes en cantidades de hasta 1 mg/ml.
Un estudio realizado sobre células de carcinomas ováricos 22 in vitro, la miscroscopía electrónica mostró que la exposición de estas células a componentes aislados de venenos de serpientes provoca la aparición de vesículas en la membrana celular que llevaron a la lisis de las células.
Los hallazgos propios son coincidentes con los citados en el uso de varios venenos, entre ellos los pertenecientes a elápidos como Naja naja, Naja naja atra, y viperinos como Vipera ammodytes, Echis coloratus y Bitis arietans , los cuales han mostrado su actividad citolítica sobre melanomas y condrosarcomas de ratón 4,11,15 . Los venenos de Vipera ruselli y Naja naja provocaron lisis celular en células de Sarcoma de Yoshida y también linfocitos de rata 2,24,26.
Experiencias realizadas con proteínas purificada a partir de anavenenos ofídicos de Naja kaouthia y Crotalus atrox (Kaotree y Atroporina) también mostraron un efecto inhibidor tanto in vitro como in vivo sobre diferentes tipos de células cancerosas sin provocar efectos indeseables propios del uso de la quimioterapia 17.
Por otro lado la utilización de dosis subletales de anavenenos ofídicos entero de Crotalus durissus terrificus demostró una actividad inhibidora de tumores ascíticos de Erlich en ratones con disminución de la tasa de crecimiento y prolongación de la vida de los ratones afectados 7,8,11,12. Finalmente, el anavenenos ofídicos entero de una especie de crotálido asiático (Trimeresurus flavoviridis) o bien sus principios activos llamados hemorraginas, han detenido el crecimiento de diferentes células cancerosas 5,25.
La bibliografía también ofrece opiniones en contrario. En efecto, es necesario destacar algunos estudios que no han obtenido efectos satisfactorios del uso de venenos de especies de Naja sobre diferentes tumores 23.
Analizando los valores hematológicos de los animales tratados con Anavenenos Ofídicos, el primer hallazgo importante es la eosinofilia, sin leucocitosis. Estos datos corroboran lo observado por otros autores con venenos de Bothrops alternatus y Bothrops neuwiedii diporus14, componentes del anaveneno bivalente y monovalente bothropico utilizado y por venenos de elápidos como Walterinessia aegypiti 11. No se observaron signos de hemólisis intravascular tal como se describe en la inyección de veneno entero de crotalidos o sus fracciones.
Por otro lado, se cita un aumento de los valores de enzimas hepáticas en la inyección de dosis subletales de veneno de cobras 10,16. Esto no se observó en los animales tratados. Asimismo, los reportes de hiperglucemia por inyección de veneno entero o fracciones de veneno de cobra (Naja naja)19 tampoco fue observado.
Si bien los casos tratados son escasos y con éxito dispar, los resultados obtenidos son alentadores y nos permiten suponer que los anavenenos ofidios pueden constituir una herramienta mas de tratamiento en el caso de algunos tipos de tumores que afectan a los caninos y felinos domésticos.
Bibliografía sobre Anavenenos Ofídicos
1. ARTHS, M. Les anavenims. Detruction de la toxicite de venims par le formol. J Physiol Path Gen 28(3):529-543,1930. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
2. BRAGANCA, B.M.; PATEL, N.T.; BADRINATH, P.G. Isolation and properties of a cobra venom factor selectively cytotoxic to Yoshida sarcoma cells. Biochem Biophsys Acta, 136: 508-520, 1967.
3. CALMETTE, A.; SAENZ, A.; COSTIL, L. Effects du venin de cobra sur les greffes cancereuses et sur le cancer spontane (adenocarcinome) de la souris. C R Acad Sci, 197: 205, 1933.
4. CHAIM-MATYAS, A.; OVADIA, M. Cytotoxic activity of various snake venoms on melanoma B16F10 and chondrosarcoma. Life Sci, 1987, 40:1601-1607,1987.
5. CONDREA, E.; DE VRIES, A. Hemolysis and splitting of human erythrocyte phospholipids by snake venoms. Biochem Biophys Acta, 84: 60-67 , 1964.
6. COTTE ,C.A.; ESSENFELD-YAHR, E.; LAIRET, C. Effects of Crotalus and Bothrops venom on normal and malignant cells cultivated in vitro. Toxicon, 10:157-161, 1972. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
7. DA SILVA, R.J. Effects of Crotalus durissus terrificus (Laurenti, 1768) venom on the evolution of Erlich ascites tumor. J Venom Anim Toxins, 3(2):324 – 341, 1996.
8. DA SILVA, R.J.; FECCHIO, D.; BARRAVIERA, B. Antitumor effects of snake venoms. J Venom Anim Toxins, 2: 79-90, 1996.
9. DONATO, N.J.; MARTIN, C.A.; PEREZ, M.; NEWMAN, R.A.; VIDAL, J.C.; ETCHEVERRY, M.A. Regulation of epidermal growth factor receptor activity to crotoxin , a snake venom Phospholipase A2 toxin. Biochem Pharmacol, 51: 1535-1543, 1996.
10. EPSTEIN, D. The pharmacology of the venom of cape cobra (Naja flava). Q J Exp Physiol 20:7-19, 1930. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
11. GAERTER, M.; GOLDBLUM, N.;GRITTER,S.; DE RIES, A. The action of various sanek vbenoms and their chromatographic fraction on animals cells in culture. J Inmnol. 88(4):527-533, 1962.
12. GILLO, L.; WIRTHENER, C.; FORAL, H. Extraction of a cancer factor from Erlich ascitis carcinoma. Nature, 211:1422-1423, 1966
13. GUL, S; SMITH, A.D. Haemolysis of washed red cells by the combined action of Naja naja phispholipase A2 and albumin . Biochem Biophys Acta 288:237-240, 1972.
14. HOUSSAY, B.A.; MARENZI,A.D.; MAZZOCO,P.Actions de venims de serpents sur les sels, la reaction et les gas du sang. C R Seanc Soc Biol. 95:1510, 1926.
15. HUANG,P.C. Effect of cobra venom on succinate cytochrome c reductase in vitro. J Formosan Med Ass. 53:128-131, 1953. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
16. IWAGUCHI, T.;TAKECHI, M.; HAYASHI, K. Cytolytic activity of cytotoxin isolated from Indian cobra venom against experimental tumor cells. Biochem Int, 10: 343-349, 1985.
17. LIPPS, B.V.Novel snake venom proteins cytolytic to cancer cells in vitro and in vivo systems. J Venom AnimToxins, 5(2):172-183, 1998.
18. MARKLAND, F.S. Antitumor action of crotalase, a defibrinogenating snake venom enzyme. Semin Thromb Hemost, 12: 284, 1986.
19. MOHAMED, A.H.; ZAKI, O.The effect of the black snake toxin on blood glucose levels. J Exp Biol 35:20-26, 1959. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
20. PATEL ,T.A.; BRAGANÇA, B.M.; BELLARE, R.A. Changes produced by cobra venom cytotoxin on the morphology of Yoshida sarcoma. Exp Cell Res, 1969, 57: 289-297, 1969.
21. PERLMUTTER, C.M.; GOLDBLUM, N.; DE VRIES, A.; GITTER, S. Dexotification of snake venoms and venoms farctions by formaldehide.Proc Soc Exp Biol Medicine.112:595-598, 1963. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
22. RUDD, C.J.; VISTAKIS, L.J.; VIDAL, J.C.; ETCHEVERRY, M.A.In vitro comparison of citotoxic effects of crotoxin in three human tumor cells lines and a normal human keratinocytes cell line. Invest New Drugs 12:183-184, 1994. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
23. SHIAU LIN ,S.Y.; SU, S.C.; LEE; C.Y. Comparative studies on cytotoxin from the Indian cobra venom and cardiotoxin from the Formosan cobra venom, with special reference to the effect on the growth of the Ehrlich ascites tumor cells in mice. J Formosan Med Assoc, 75: 328-336, 1976.
24. TU, A.; GILTNER; J.B. Cytotoxic effects of snake venoms on KB and Yoshida cells. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 9: 783-786, 1974.
25. YOSHIKURA, H.;OGAWA, H.; OHSAKA, A.; OMORI-SATOH, T. Action of Trimeresurus flavoviridis venom and partially purified hemorrhagic principles on animal cells cultivated in vitro. Toxicon, 4: 183-190, 1966.
26. ZAHEER, A.; BRAGANCA, B.M. Comparative study of three basic polypeptides from snake venoms in relation to their effects on the cell membranes of normal and tumour cells. Cancer Biochem Biophys,5: 41-46, 1990. (Recomendado para ampliar la informacion sobre anavenenos ofídicos).
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